乳腺癌组织缺氧与雌激素受体-α的关系

[摘要]  目的：缺氧是乳腺癌常见的现象，并可能诱导肿瘤的进展。雌激素受体(ER)-α状态是乳腺癌预后和内分泌治疗疗效的重要预测指标。本研究旨在揭示乳腺癌中缺氧与ER-α表达的关系。方法：51例患者经配体结合法证实为ER阳性的乳腺癌。采用免疫组织化学染色的方法观察ER-o的异质性表达与多种缺氧标志的关系。结果：免疫组织化学染色发现本组有49例乳腺癌为ER-a阳性。无论乳腺导管内癌(n=29)还是浸润性癌(n=20)，ER-α蛋白在邻近坏死灶的区域都出现了下降(P分别≤0.0001)；ER-α的区域性下调还与缺氧诱导基因CA-IX和Glut-1的表达有关(P<0.0001)。结论：乳腺癌中ER-α区域性的表达下降与缺氧有关。因此缺氧可能促使乳腺癌在进展过程中向ER-α阴性的表型演变。


    [关键词]  乳腺肿瘤；雌激素受体；缺氧

    缺氧是实体肿瘤中十分常见的现象。缺氧可以导致肿瘤一系列的病理及生物化学改变，包括坏死、细胞糖酵解的增加、脂肪氧化的下降以及肿瘤新生血管的形成等^[1,2]。一般认为缺氧诱导因子(HIF)-1-α是介导上述缺氧相关改变的核心物质^[3]。缺氧通过诱导细胞HIF-α的上调，进而导致许多缺氧反应基因的表达增加，其中包括碳酸酐酶(CA)-IX^[4,5]、葡萄糖转运蛋白(Glut) ^[6]。以往的研究发现乳腺导管内癌(DCIS)中ER-ct阴性的病例往往与粉刺样类型，即组织中伴有大量坏死的类型有关^[7,8]。本研究的目的旨在从细胞水平揭示乳腺癌组织中ER-o的异质性表达与坏死灶以及其他肿瘤缺氧标志物的关系。

    材料和方法

    一  组织标本  人选的标本必须同时满足下列条件：①ER阳性；②伴有明显的肿瘤坏死；③无细针、空芯针穿刺活检史和术前辅助放、化疗史。ER阳性的标准为配体结合法测得ER含量>10 fmol/mg蛋白。明显的肿瘤坏死定义为肿瘤坏死灶累及5％以上的乳腺DCIS的导管，或者占浸润性乳腺癌组织面积的5％以上。经过筛选后共获得51例乳腺癌，其中包括31例DCIS和20例浸润性乳腺癌。

    二  免疫组织化学(IHC)检测  在每例石蜡块标本的相同切面连续制备5μm厚的切片数枚以供不同蛋白的IHC检测。检测的蛋白以及所用的抗体和浓度如下：ER-α，ER-6F11  抗体(Novocastra)，1：50；HIF-1-α，HIF-1-α抗体(NovusBiologicals)，1：750；CA-IX，M75抗体^[5]，1：200；Glut-1，Glut-1抗体(Chemicon International)，1：3 000；孕激素受体(PR)，PR抗体(Novocastra)，1：50。所有的IHC染色过程均由一台自动组织免疫染色机(VentanaMedicalSystem，Phoenix，AZ)及配套试剂盒(DAB immunohistochemistry kit)按照设定的程序在室温下进行。除HIF-1-α之外的目标蛋白的特异性抗体(一抗)和抗抗体(二抗)的温育时间各设置为30分钟。而HIF-1-α的染色根据以往的经验，采用增强的抗原热修复方法[95℃下置于Tris／硼酸／EDTA缓冲液(pH=8.0)中温育1小时]，一抗的温育时间延长为12小时(过夜)，二抗温育时间为30分钟。每批染色均设阳性和阴性对照，阴性对照采用磷酸盐缓冲溶液(PBS)取代一抗。

    三  评定标准  所有的IHC染色切片采用光学显微镜进行观察，并由两名研究者共同读片及评定。ER-α和PR蛋白的表达水平的评定采用目前国际上常用的半定量IHC评分法，它包括对细胞核染色的比例及强度两部分的评分。核染色细胞比例评分的方法：0为无表达(包括仅细胞膜有染色)；1为<1％的肿瘤细胞有表达；2为1％-10％的肿瘤细胞有表达；3为10％至1／3的肿瘤细胞有表达；4为1／3-2／3的肿瘤细胞有表达；5为超过2／3的肿瘤细胞有表达。核染色强度评分的方法：0为无染色；1为弱染色；2为中度染色；3为强染色。将比例评分与强度评分相加最后得出总评分，评分结果可为0-8分不等。临床实践中一般IHC评分：0-2定义为阴性，3-4分为低表达，5-6分为中表达，7-8分为高表达。本研究中对HIF-1-α(细胞核染色)、CA-IX(细胞膜染色)和Glut-1(细胞膜染色)表达的评定仅采用阳性和阴性来描述。

    四  统计处理  采用Wilcoxon配对t检验比较特定肿瘤区域之间ER-ctIHC评分的差异。

    结果

    ER-α与乳腺痛坏死灶关系  本组51例乳腺癌标本经配体结合法检测显示中位ER水平为69(12-270)fmol／mg。为了同时了解蛋白在肿瘤组织中的表达水平和分布情况，我们采用免疫组织化学的方法对这51例标本的ER-α再次进行了检测和评定。结果49例为阳性，2例为阴性；阳性标本中5例为低表达，19例中表达，25例高表达。ER-α的表达水平在绝大多数阳性标本中都存在区域间的差异。为研究ER-α的分布与肿瘤坏死灶的关系，我们对每例标本中邻近坏死灶的肿瘤区域，即距离坏死灶边缘50 μm之内的所有肿瘤细胞进行ER-α的IHC评分。结果本组大部分病例，包括24／31(77％)的DCIS和9／20(45％)的浸润性癌，在邻近坏死灶的区域显示ER-ct阴性或低度表达。若将该区域与每例标本中相应的远离坏死灶区域(定义为距坏死灶边缘100μm到200 μm之间的所有肿瘤细胞)进行配对比较，则发现49例受体阳性标本中有42例(86％)的ER-α在邻近坏死灶区域出现明显下调。Wilcoxon配对t检验显示这种ER-α的区域性表达差异在DCIS和浸润性癌中均具有显著统计学意义(P<0.0001和P=0.0001)。

    二  ER-α与HIF-1-α的关系  HIF-1-α是介导细胞缺氧反应的主要分子，同时也是非常重要的缺氧反应标志物之一。本组HIF-1-α阳性的病例占33％(17／51)；在每例阳性的标本中HIF-1-α核染色的肿瘤细胞仅占很小比例(<5％)，并且几乎都位于肿瘤坏死灶附近，即ER-α阴性或低表达区。比较典型的表现是乳腺坏死灶旁数个至十数个核染色的肿瘤细胞。

    三  ER-α、PR与CA-IX和Glut-1的关系  我们用IHC法检测本组51例乳腺癌另外两个缺氧诱导蛋白CA-IX和Glut-1的表达状况。结果共有31例(61％)标本至少表达上述一种缺氧标志，其中6例仅CA-IX阳性，16例仅Glut-1阳性，9例为两者都阳性。大多数CA-IX或Glut-1的膜染色信号都分布在邻近坏死灶的乳腺癌区域，极个别信号位于肿瘤间质附近。我们同时观察了这些膜染色区域内ER-α表达情况，发现有80％的CA-IX阳性或CA-Ⅸ与Glut-1双阳性的区域，以及56％的Glut-1阳性区域中无ER-α表达；统计学分析显示这些膜染色区域的ER-α表达水平显著低于其所在标本的总的ER-α表达水平(P<0.001，Wilcoxon配对t检验。

    PR是提示ER-α具有转录活性和对雌激素有反应的分子指标之一。本组PR检测的阳性率为51％。IHC染色结果显示肿瘤组织中PR表达水平的区域间差异与ER-ct并不完全一致，但是在邻近坏死灶尤其是CA-IX／Glut-1阳性的乳腺癌区域则出现类似于ER-α的下调现象(数据未列出)。

    讨论

    肿瘤组织的缺氧往往与坏死、血管再生、糖酵解增加等一系列病理和生物化学改变有关，而本研究发现在乳腺导管原位癌和浸润性癌组织中缺氧还与ER-α的水平有关，表现为邻近坏死区域ER-α蛋白下调，而同时一些缺氧标志物特异性的表达增高。

    近年的体外实验研究发现急性缺氧环境会使乳腺癌细胞系ER-ct经蛋白酶途径的降解(KPL-1^[9]、ML-20^[9]、ZR-75^[10])。而在乳腺癌组织中坏死和某些缺氧反应的标志，例如依赖于HIF-1-α的缺氧反应基因CA-IX也都与肿瘤ER-α阴性的状态密切相关^[5，7]。然而另一些缺氧反应标志物，尤其是主导缺氧反应的关键因子HIF-1-α本身与ER-α表达的关系目前还存在较大的争议。例如，一些研究发现在肿瘤细胞系^[11]或者浸润性乳腺癌组织^[12，13]中HIF-1-α与ER-α的表达不相关；另外至少有一项研究发现在乳腺原位癌和浸润性癌中HIF-1-α的表达与高水平的ER-α有关^[14]；而最近的一项研究则提示两者呈负相关^[15]。导致研究结果不一致的原因之一可能是HIF-1-α蛋白的表达受到多种因素的严密调控，在体外诱导的表达中也往往呈一过性^[16]。相比之下其他一些缺氧标志分子如CA-IX和Glut-1蛋白则比较稳定，因而能在缺氧反应中以及恢复正常氧分压后可持续较长时间的表达^[17]。此外许多研究仅仅观察了肿瘤个体之间HIF-1-α的表达与ER-α状态的关系，而没有比较肿瘤细胞之间两者的相关性。

    本研究中我们选择了一组同时存在肿瘤坏死和ER-α阳性的乳腺DCIS及浸润性乳腺癌作为研究对象，采用免疫组织化学染色的方法观察ER-α的分布与缺氧的关系，并选择坏死灶、CA-IX和Glut-1的表达作为组织缺氧的标志。在进行IHC检测前ER-α的表达水平是通过配体结合法确定的，这两种检测结果虽无法达到完全吻合，却仍具有较高的一致性^[18]，本组IHC检测的结果即显示有24／31的DCIS和20／20的浸润性癌组织中的ER-ct呈中度到高度表达。在这些乳腺DCIS和浸润性癌中，我们都观察到在距离坏死灶边缘50 μm以内的肿瘤区域，也是CA-IX和(或)Glut-1表达高度集中的区域，ER-α和PR的IHC评分明显低于没有CA-IX或Glut-1表达的距坏死灶边缘100-200 μm范围之间的肿瘤区域。选择上述距离标志来定义缺氧与非缺氧区域的原因是，根据以往其他研究者以及我们自己的观察发现实体肿瘤的缺氧在距离最近的血管平均80 μm(40-140μm)处就开始出现，而细胞死亡和坏死财发生在距离血管平均130 μm(80-200μm)和更远的区域，两者的起点相距约50μm^[18]。在乳腺癌组织中我们观察到PR与ER-α在坏死灶附近几乎一致的出现下调，考虑到PR乃ER-α的下游基因产物，因此推测由于ER-α下调所致的转录活性下降是PR蛋白下调的直接原因。

    临床研究发现乳腺癌中肿瘤坏死及缺氧标志物(markersofhypoxic response)往往与肿瘤的进展或者预后不良有关^[8,12,13]；而ER-α阴性的乳腺癌也是恶性程度相对较高的亚型。因此本研究中ER-α与缺氧所表现出的相关性可能为研究乳腺癌进展的机制提供新的线索。