乳腺癌耐药蛋白在乳腺癌组织中的表达及其与预后的关系

[摘要]  目的：研究乳腺癌耐药蛋白(BCRP)在乳腺癌组织中的表达，评估其在乳腺癌预后中的作用。方法：采用免疫组织化学方法(IHC)检测60例手术切除的乳腺癌组织中BCRP的表达，并分析其与临床病理特征的关系及对预后的影响。结果：①BCRP在乳腺癌组织中的阳性表达率为35％(21／60例)；②腋淋巴结或激素受体阳性者BCRP表达水平显著高于腋淋巴结阴性者和激素受体阴性者(P<0.05)，BCRP表达与年龄、月经状况、肿瘤大小和组织学分级均无关(P>0.05)；③Kaplan-Meier生存分析结果表明BCRP表达与无病生存期显著相关(P<0.05)，但和总生存期无关(P>0.05)；④Cox单因素和多因素分析都显示肿瘤大小、淋巴结转移和雌激素受体(ER)与无病生存期和总生存期显著相关(P<0.05)，另外孕激素受体与总生存期(P<0.05)显著相关。结论：BCRP在乳腺癌组织中具有一定的表达水平，与乳腺癌患者的无病生存期有关，而与总生存期无关。
    [关键词]  乳腺癌；乳腺癌耐药蛋白；预后；免疫组织化学
    导致乳腺癌治疗失败的主要原因之是就是对化疗药物耐药，国内外研究表明，肿瘤耐药涉及及细胞内药物浓度降低、药物靶分子改变、代谢解毒及DNA损伤修复功能增强等多种机制，与多种耐药相关基因有关，乳腺癌耐药蛋白用为新近发现的一个ATP结合盒(adenosine  triphOshpate-binding  cassette，ABC)膜转运蛋白超家族成员，在多药耐药方面有着不可忽视的地位^[1]，国内外仅有少量关于BCRP的报道。本研究采用免疫组织化学方法检测BCRP在乳腺癌组织中的表达，以评估其在判断乳腺癌预后中的作用。   
    材料和方法
    一  标本  全组60例标本，其中44例伴淋巴结转移，选自黑龙江省肿瘤医院1992-1994年间，经病理证实且有随访和预后资料的女性乳腺癌患者组织。所有病例在诊断时无远处转移证据并给予手术切除，标本经4％甲醛固定，石蜡包埋，连续制成4 μm厚切片若干张，分别进行HE和IHC染色。
    二  组化试剂  一抗为大鼠抗人BXP-21(IgG2a，1：20)单克隆抗体，系荷兰Monosan公司产品；S-P和DAB试剂盒为北京中山公司产品。分别用已知的正常组织或肿瘤组织阳性片作阳性对照，用10％正常动物血清代替一抗作阴性对照。
    三  染色步骤  石蜡切片常规脱蜡、水化；加3％过氧化氢甲醇溶液50 μl阻断过氧化物酶后，加热修复抗原10分钟；加10％正常山羊血清50μl封闭，室温温育10分钟；加第一抗体，室温温育120分钟；加生物素标记的第二抗体50 μl，室温温育10分钟；加辣根酶标记的链霉卵白素溶液50 μl，室温温育10分钟；加新鲜配制DAB溶液100μl显色。以上各步骤之间均用缓冲液冲洗3次，共15分钟，苏木精对比染色、脱水、透明、封固，镜下观察。
    四  评定标准  由两位免疫组化室的病理医师在不知道任何临床和病理资料的情况下对免疫组化染色共同评估，根据肿瘤细胞染色程度以及阳性细胞所占百分比进行综合评分，阴性(-)：阳性细胞占25％以下且染色极浅；弱阳性(±)：阳性细胞占25％-50％，染色呈淡黄色；阳性(+)：阳性细胞在50％-75％之间，染色为棕黄色；强阳性(++)：阳性细胞占75％之上，染色为棕褐色。将(-)和(±)归为低表达组，(+)和(++)归为高表达组。
    五  统计方法  用SPSSl0.0统计软件进行统计分析，乳腺癌耐药蛋白和临床病理特征的关系采用／检验，Kaplan-Meier法计算生存曲线并用logranktest比较，预后分析采用单因素和多因素Cox回归模型。
    结果
    一  耐药蛋白在乳腺癌组织内的表达  BCRP阳性表达部位主要出现在细胞质和细胞膜，呈棕黄色颗粒状，弥漫或散在分布；此外BCRP在某些间质细胞也可呈阳性，但较癌组织染色浅，且分布范围小而不均匀。本组乳腺癌组织标本中阴性39例，阳性21例，阳性率为35％(21／60例)。
    二  乳腺癌耐药蛋白表达与临床病理特征的关系  BCRP表达水平在腋淋巴结转移者(19／44例)显著高于腋淋巴结阴性者(2／16例)(P<0.05)，并且在激素受体阳性者(ER 14／28例；PR 15／28例)高于激素受体阴性者(7／32例；6／32例)(P<0.05)，但与月经状况、肿瘤大小、组织分级均无关(P>0.05)。
    三  乳腺癌耐药蛋白表达与生存期的关系Kaplan-Meier生存分析结果表明：BCRP表达与患者的无病生存期明显相关(P<0.05)，但BCRP表达和总生存期无关(P>0.05)，即BCRP阳性组无病生存期短于BCRP阴性组，而患者总生存期并无缩短。
    四  乳腺癌耐药蛋白表达与预后的关系  Cox单因素和多因素分析显示肿瘤大小、淋巴结转移和ER与无病生存期和总生存期显著相关(P<0.05)，另外PR与总生存期明显相关(P<0.05)，由此可见肿瘤大小、淋巴结转移和ER是影响乳腺癌预后最重要的因素，而BCRP与预后无关。
    讨论
    肿瘤耐药是多基因参与的结果，了解耐药基因的表达，对于选择合适的治疗方案和实施有效的逆转措施具有重要的指导意义，而且耐药蛋白作为一种新型预后标志也引起人们的普遍关注。近来有研究认为BCRP可能与急性粒细胞白血病的耐药有关^[2-4]，然而其在乳腺癌中是否与预后有关还不清楚。
    BCRP与P-gp同属ABC超家族膜转运蛋白，与典型的ABC转运蛋白不同的是只含有一个ATP结合结构域和一个疏水性的跨膜结构域，因此称其为半转运蛋白^[5]。BCRP主要通过结合和水解ATP并利用能量将胞内的药物泵出，降低胞内药物浓度从而导致耐药。基因转染实验为BCRP导致耐药提供了直接证据^[6]。
    ScheffeF^[7]等从被MCF-7耐药细胞系免疫的小鼠身上分离出BXP~I单克隆抗体，它能与BCRP蛋白发生特异性反应，此抗体与细胞中一些过度表达的MDR膜转运蛋白分子缺乏粘附，表明它不会与P-gp、MRPl等发生交叉反应。我们用BXP41作为检测BCRP的单克隆抗体，发现BCRP定位于细胞质膜^[8]，研究结果显示BCRP阳性表达率为35％，显示乳腺癌组织中BCRP具有一定水平的表达。Atsuko等^[9]报道采用RT-PCR方法检测BCRP在乳腺癌患者的表达率较低，Ian等^[10]采用免疫组织化学方法检测结果也较低。
    本组研究显示BCRP和腋淋巴结转移明显相关，腋淋巴结转移者BCRP表达明显高于淋巴结阴性者，提示BCRP可能与肿瘤侵袭状况有关；此外在研究中还发现BCRP与激素受体状况明显相关，激素受体阳性者BCRP表达明显高于激素受体阴性者，Imai等^[11]研究发现雌激素酮和17β-雌二醇可逆转BCRP调节的多药耐药，Whelan等^[12]报道激素受体状况在表达多药耐药的乳腺癌细胞中是可以改变的，其机制还不十分清楚。与本组研究结果不同的是Atsuko等^[9]报道BCRP表达与乳腺癌的临床特征没有相关性，Ian等^[10]报道恶性度高的乳腺癌组织BCRP表达较低，提示BCRP可能是细胞分化的一个指标。因此BCRP与乳腺癌临床特征的关系还有待进一步研究。
    Kaplan-Meier生存分析结果显示BCRP表达和乳腺癌患者的无病生存期相关，提示其可作为判断肿瘤复发转移的有关指标，可能与术后结合非MDR型药物及内分泌治疗有关，有待于累积病例进行前瞻性研究证实。Atsuko等^[9]报道BCRP表达对经过多柔比星(阿霉素)治疗的乳腺癌患者的复发或预后没有相关性。本研究显示BCRP表达和乳腺癌患者的无病生存期相关，和总生存期无关，在Cox单因素和多因素分析时未能进入回归模型，与文献报道略有差异，可能与标本、试剂等因素有关。
    总之，我们对BCRP在乳腺癌组织中的阳性及其与预后关系的研究在国内尚属首次，初步研究结果显示BCRP在乳腺癌患者中具有一定的阳性率，BCRP阳性与乳腺癌患者的无病生存期有关，但与总生存期无关，有待于进一步累积资料证实。